J Exp Med︱蒋典华团队揭示HER2是调控肺成纤维细胞侵袭和肺纤维化新靶点

撰文︱刘学

责编︱王思珍，方以一

编辑︱方以一

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明的慢性侵袭性肺病， 这种疾病的组织学特点是过量的肺成纤维细胞聚集以及过量的细胞外基质的分泌和沉积，从而导致肺部气体交换功能的破坏[1]。IPF患者在被诊断后，通常只有2-5年的生存期，而目前临床上唯一有效的治疗手段，只有肺移植[2]。临川批准的药物， pirfenidone and nintedanib， 虽然能够一定程度上减缓IPF的进展，但是并不能有效的减少肺纤维化和改善患者肺功能[3, 4]。因此，寻找新的更有效的IPF的治疗靶点，在临床上就显得更为急切。

肺成纤维细胞是肺组织细胞里的重要组成部分，在正常情况下，成纤维细胞通常位于肺泡和毛细血管之间的组织间隙中[3]。而IPF的一个主要的病理学特征，就是肺成纤维细胞的过度增生和聚集，分泌和堆积过量的细胞外基质，从而破坏进行气体交换的肺泡组织[2]。近年来多项研究证明，侵袭性的肺成纤维细胞能够促进肺纤维化的发展[6]。然而，调控肺成纤维细胞侵袭的基因谱以及关键调控因子，目前还不清楚。

2022年8月18日，美国洛杉矶Cedars-Sinai Medical Center的Paul Noble教授、蒋典华教授课题组在Journal of Experimental Medicine上发表了题为“HER2 drives lung fibrosis by activating a metastatic cancer signature in invasive lung fibroblasts”的研究。该研究基于单细胞转录组测序发现用于鉴定侵袭性和非侵袭性肺成纤维细胞的转录因子和细胞表面蛋白，并揭示了调节这些基因表达差异以及肺纤维化的关键调节因子HER2，为特发性肺纤维化的临床研究和治疗，提供了新的潜在靶点。

多项研究都证实，来源于IPF患者肺组织的成纤维细胞，具有更高的侵袭性，而成纤维细胞的这一表型，对于肺纤维化的发展具有显著的促进作用（图1A, B）[6, 7]。在该项研究中，作者通过单细胞转录组测序，揭示了侵袭性和非侵袭性肺成纤维细胞的基因表达谱，以及差异表达基因（图1C-E），并通过进一步的分析，分别发现了侵袭性肺成纤维细胞特异性的细胞表面蛋白，非编码RNA和转录因子基因（图1F）。

图1 侵袭性和非侵袭性肺成纤维细胞的单细胞转录组测序

（图源：Liu X, et al., J Exp Med, 2022）

紧接着，利用流式细胞分选技术，作者利用新发现的细胞表面蛋白SEMA7A，F3和ITGA6，分别将IPF病人来源的肺成纤维细胞分选为表达高和低的两组，分别验证了其表达水平以及细胞迁移和侵袭能力（图2A-D），从而证实这些侵袭性肺成纤维细胞特异性的细胞表面蛋白的表达水平，和成纤维细胞的侵袭性是显著正相关的，而在这三个基因中，SEMA7A最具有代表性，说明SEMA7A可以作为分选侵袭性和非侵袭性肺成纤维细胞的细胞表面蛋白。

为了进一步验证SEMA7A在肺成纤维细胞侵袭中的作用，作者建立了SEMA7A过表达的肺成纤维细胞系，SEMA7A的过表达显著增加了成纤维细胞的迁移和侵袭性，同时在新鲜分离的肺成纤维细胞中，SEMA7A阳性的细胞，在IPF患者中显著高于正常人水平（图2A-E），说明在IPF患者的肺组织中，侵袭性的成纤维细胞的比例是显著升高的。同时，作者利用免疫缺陷型小鼠(NOD-scidIL2Rγc−/−，NSG)，建立了人源化的IPF小鼠模型[8]，通过这一小鼠模型，作者发现，SEMA7A的过表达能够显著增加肺成纤维细胞诱导的小鼠肺纤维化水平（图2F-G），说明SEMA7A不仅可以作为一个侵袭情肺成纤维细胞的细胞表面蛋白，同时在成纤维细胞的侵袭和肺纤维化过程中也发挥着重要作用。

图2 侵袭性肺成纤维细胞的细胞表面蛋白功能研究

（图源：Liu X, et al., J Exp Med, 2022）

接下来，作者进一步验证了新发现的侵袭性和非侵袭性成纤维细胞特异性转录因子基因的表达，进一步通过siRNA干扰技术，分别敲低这些转录因子在肺成纤维细胞里的表达水平，这些基因的敲低，分别逆转了肺成纤维细胞的迁移和侵袭性（图3A-E），说明这些基因对于肺成纤维细胞的迁移和侵袭发挥重要作用。

图3 侵袭性和非侵袭性肺成纤维细胞特异性转录因子的功能研究

（图源：Liu X, et al., J Exp Med, 2022）

接下来为了进一步研究调节以上这些基因的关键调节因子，作者通过IPA（Ingenuity Pathway Analysis）对这些差异表达基因进行信号通路和上游调节因子的分析。作者发现在调节成纤维细胞侵袭的关键调节因子中，ERBB2（Erb-B2 Receptor Tyrosine Kinase 2）有最高的-Log10(FDR)和Activation Z-score（图4A-B），说明这一信号通路在调节成纤维细胞的侵袭中，起着关键的作用。众所周知，ERBB2，又称HER2，对在包括肺腺癌和乳腺癌的等恶性癌症的发生发展中起着重要作用，为了探究肺成纤维细胞的上游调节因子在肺腺癌中的作用，作者利用近期发表的原发性和转移性肺腺癌的单细胞转录组测序数据，发现在侵袭性肺成纤维细胞中被活化的上游调节因子，绝大多数在转移性的肺腺癌细胞中也被激活，而在侵袭性肺成纤维细胞中被抑制的上游调节因子，多数也在转移性肺腺癌细胞中被抑制（图4C-D），这一发现说明调节肺成纤维细胞侵袭的上游调节因子谱，与肺腺癌的恶行转移有着极高的相似性。

为了进一步验证ERBB2（HER2）在侵袭性成纤维细胞中被活化，作者分别通过流式细胞分选分别从培养的原带成纤维细胞中分选SEMA7A高表达（侵袭性）和低表达（非侵袭性），以及从新鲜分离的正常和IPF肺中的成纤维细胞。Western Blotting分析发现侵袭性和IPF肺成纤维细胞的磷酸化HER2（p-HER2）的表达水平，显著高于非侵袭性和正常肺成纤维细胞，而总体HER2的水平，在多数IPF患者的侵袭性肺成纤维细胞中，也是显著升高的（图4E-H），这些数据证实ERBB2（HER2）是IPF肺成纤维细胞侵袭中被激活。

图4 ERBB2调控因子在侵袭性肺成纤维细胞中被显著活化

（图源：Liu X, et al., J Exp Med, 2022）

为了进一步探究ERBB2（HER2）在肺成纤维细胞侵袭中的作用，作者分别进行了HER2在肺成纤维细胞中 gain-of-function和loss-of-function的研究。作者发现，在正常人的肺成纤维细胞中过表达ERBB2（HER2），能够显著升高成纤维细胞的侵袭性基因谱的表达，并且能够显著升高成纤维细胞的侵袭性以及在NSG小鼠中的肺纤维化水平（图5A-E）。而在IPF成纤维细胞中敲低ERBB2（HER2）能够显著降低成纤维细胞的侵袭性基因谱的表达和降低成纤维细胞的侵袭。这些发现进一步证实HER2这一调节因子在肺成纤维细胞的侵袭中起着重要的作用。

图5 ERBB2（HER2）过表达显著增加肺成纤维细胞的侵袭和肺纤维化

（图源：Liu X, et al., J Exp Med, 2022）

为了证实ERBB2（HER2）在肺成纤维细胞侵袭和肺纤维化中的作用，作者利用HER2的抑制剂Lapatinib以及Genentech赠与的HER2中和性抗体Pertuzumab，来抑制HER2信号通路在成纤维细胞中的活性，作者发现Lapatinib和Pertuzumab对IPF成纤维细胞的侵袭性都有着显著的抑制作用（图6A-F），同时对侵袭性成纤维细胞诱导的NSG小鼠肺纤维化有着显著的治疗效果（图6G-H）。这些发现进一步证实靶向抑制HER2在成纤维细胞中的活性，能够有效的抑制成纤维细胞的侵袭和肺纤维化。

图6 抑制ERBB2（HER2）活性有效抑制肺成纤维细胞的侵袭和缓解肺纤维化

（图源：Liu X, et al., J Exp Med, 2022）

图7 ERBB2（HER2）是IPF肺成纤维细胞侵袭和肺纤维化的重要上游调节因子

（图源：Liu X, et al., J Exp Med, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究基于单细胞转录组测序首次系统地揭示了特发性肺纤维化（IPF）患者肺中侵袭性和非侵袭性成纤维细胞的基因表达谱，并通过差异表达分析，分别揭示了侵袭性和非侵袭性成纤维细胞特异性的细胞表面蛋白，非编码RNA以及转录因子基因。并通过进一步的功能研究，发现这些基因在调节IPF患者肺成纤维细胞的侵袭中起着重要作用。通过进一步的信号通路分析，该研究发现调节肺腺癌转移的关键上游调节因子，与调节肺成纤维细胞侵袭的调节因子有着高度的一致性，在这些调节因子中，在侵袭性IPF肺成纤维细胞中最显著激活的是ERBB2（HER2）信号通路。ERBB2（HER2）的活化，在培养的原代侵袭性IPF肺成纤维细胞，以及新鲜分离的IPF肺成纤维细胞中，被进一步证实。功能上，在正常人肺成纤维细胞中过表达ERBB2（HER2）能够显著增加侵袭性肺成纤维细胞基因谱的表达并同时增加成纤维细胞的侵袭性，而在IPF成纤维细胞中敲低ERBB2（HER2）能够显著降低侵袭性肺成纤维细胞基因谱的表达并同时降低成纤维细胞的侵袭性。通过化学抑制剂和中和性抗体，抑制ERBB2（HER2）在IPF成纤维细胞中的活性，能够有效地抑制IPF肺成纤维细胞的侵袭性，以及侵袭性肺成纤维细胞诱导的小鼠肺纤维化。这一研究进一步阐释了侵袭性肺成纤维细胞对肺纤维化的影响，并且为IPF的临床研究和诊治提供了新的靶向。

原文链接：https://rupress.org/jem/article/219/10/e20220126/213410/HER2-drives-lung-fibrosis-by-activating-a?searchresult=1

该研究主要贡献作者包括Cedars-Sinai Medical Center的Project Scientist刘学和江南大学生命科学与健康工程学院的副教授耿燕，该研究受到来自美国NIH的多个基金项目的资助。

通讯作者：蒋典华（左）、Paul Noble（右）

（照片提供自：蒋典华/Paul Noble团队）

蒋典华/Paul Noble实验室长期从事肺纤维化的发生机制的研究，近年来该实验室在肺泡干细胞和气道上皮细胞的功能研究，肺损伤修复和肺纤维化的信号机制，以及侵袭性肺成纤维细胞在肺纤维化中的作用和机制研究中，取得了多项突破性的发现 (Nat Med 2016; 22:1285; J Clin Invest. 2016; 126:3063; JCI Insight 2019;4:e125326; iScience. 2021; 24(6):102551; J Clin Invest. 2022;132:e157338, J Exp Med 2022:10.1084/jem.20220126)。实验室现面向全球，公开招聘多位博士后，期待诸位有意向的科学家共同加入，为IPF的基础和临川研究，提供新的思路和线索。

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参考文献（上下滑动阅读） 

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本文完